Věda a výzkum

• organizaci chromatinových domén vyššího řádu,
• integraci procesů DNA replikace a RNA syntézy a maturace do jaderných substruktur,
• organizaci chromatinového vlákna.

Pro vědecké experimenty jsou na pracovišti využívány genetické, biochemické, molekulárně biologické, strukturně biologické a buněčně biologické přístupy. Významnou měrou se využívají moderní metody světelné a elektronové mikroskopie včetně „live cell imaging", elektronmikroskopické tomografie a kryo-elektronové mikroskopie umožňující pozorování vitrifikovaných hydratovaných preparátů. Nově zavedené moderní metody elektronové mikroskopie umožnily pracovišti proniknout do oblasti nanotechnologií. V novém projektu je na pracovišti také vyvíjen nový typ světelného mikroskopu - programovatelný maticový mikroskop (PAM).

Funkční organizace buněčného jádra

Organizace chromatinových domén vyššího řádu

• Fluorescenčním označením oblastí chromatinu bylo na živých HepG2 buňkách exprimujících rekombinantní protein histon H4-Dendra2 sledováno, do jaké míry je zachována pozice vybraných chromatinových domén v jádře po buněčném dělení. Bylo zjištěno, že ve srovnání s buňkou mateřskou je v dceřiných buňkách rozmístění vybraných oblastí chromatinu výrazně jiné, i když ne zcela náhodné (Cvačková et al., 2009).
• Byl popsán nový fenomén reversibilní a na teplotě závislé imunofluorescenční detekce jaderného epitopu epiC rozpoznávaného monoklonální anti-aktinovou protilátkou. Výsledky prokázaly s replikací spřaženou modulaci raně se replikujícího chromatinu, projevující se epiC positivitou, která zahrnuje úsek buněčného cyklu od S fáze do časné G1 fáze (Fidlerová et al., 2005). Podrobnou imuno(cyto)chemickou analýzou byl epiC identifikován s dvojí posttranslační modifikací na histonu H4 (lysin K16 acetylován, lysin K20 nesoucí dvě metylové skupiny). EpiC zjevně představuje důležitou značku pro přenos a uchovávání epigenetické informace na transkripčně kompetentní části genomu (Fidlerová et al., 2009).
• Ve spolupráci s univerzitou v Buffalo, USA (Prof. R. Berezney) byla kombinací FISH a moderních metod chromozomové analýzy rozluštěna organizace interferonového genového klastru v lidských nádorových buňkách. Studováno bylo jak prostorové uspořádání interferonového genového shluku, tak i uspořádání asociovaných segmentů chromozomů a repetic centromerové DNA v trojrozměrné struktuře interfázového buněčného jádra. Zjištěné prostorové uspořádání umožnilo navrhnout model vytváření interferonového genového shluku a možností jeho sdružování s okolními chromozomovými oblastmi (Marella et al., 2008; Zeitz et al., 2009).
• Replikační protein A (RPA) má důležitou roli při replikaci, opravách a rekombinaci DNA. V in vitro rekonstituovaných jádrech Xenopus laevis jsme restriktázami experimentálně vyvolali dsDNA zlomy. Po omezeném působení restriktáz došlo v jádrech k vytvoření strukturně distinktních ohnisek, která byla obohacena RPA a proteinem Ku. Navazující biochemické, molekulárně biologické, ultrastrukturní, imunocytochemické a in situ hybridizační výsledky prokázaly, že in vitro rekonstituované jádro Xenopu představuje vhodný model pro studium mechanizmů uplatňujících se při opravách ds DNA zlomů (Eltsov et al., 2000; Grandi et al., 2001).
• Ve spolupráci s Biofyzikálním ústavem ČAV v Brně bylo "ChIP-on-chip" analýzou kompletního genomu lidských embryonálních kmenových buněk prokázáno, že pouze 117 z celkového počtu 24659 promotorů se podílí na pluripotenci těchto buněk a 25 acetylovaných promotorů je pravděpodobně zodpovědných za jejich diferenciaci na endodermní typ buněk. Analýza úrovně acetylace histonu H3 na lysinu K9 napověděla, že chromozomy 11, 12, 17 a 19 hrají při tomto typu diferenciace nejdůležitější roli a jsou pro pluripotenci lidských kmenových buněk esenciální (Krejčí et al., 2009).
• Ve spolupráci s Biofyzikálním ústavem ČAV v Brně bylo při studiu vlivu laminů na organizaci chromatinu zjištěno, že nepřítomnost laminů typu A/C má za následek kondenzaci chromozomových teritorií a reorganizaci centromerického heterochromatinu. Tyto změny bylo možné do velké míry zvrátit zablokováním histon-deacetylázy. To naznačilo, že interakce mezi laminy a specificky modifikovanými histony může hrát důležitou roli ve struktuře chromatinu na vyšších úrovních jeho organizace (Galiová et al., 2008).
• Pro pochopení vytváření vyšších chromatinových struktur na úrovni buněčného jádra jsme pomocí mikroskopických metod studovali také genové umlčování způsobené Polycomb proteiny. V roce 2011 jsme publikovali výsledky (Smigova et al.) týkající se identifikace „Polycomb tělíska“ na ultrastrukturní úrovni. Definovali jsme jej jako lokální prostorové nahromadění heterochromatinových struktur. „Polycomb tělísko“ tedy nemá znaky umlčující továrny nebo „klasického“ jaderného tělíska tak, jak je definováno. Na základě našich výsledků jsme navrhli model „Polycomb tělíska“, který může pomoci porozumět genovému umlčování na úrovni jádra jako celku.

Strukturně-funkční projevy replikační aktivity

• Získané výsledky umožnily popsat dynamiku replikačně aktivních chromatinových domén v jádře (Mašata et al., 2005), určit rychlost postupu „replikační vidličky" a prokázat rozdílné rychlosti replikace DNA v časné a pozdní S fázi buněčného cyklu (Malínský et al., 2001).
• Elektronovou mikroskopií byly identifikovány rozměrově stejnorodé replikačně aktivní chromatinové domény (Koberna et al., 2004), které představují základní strukturně-funkční jednotky replikujícího se chromatinu.
• In vivo značení DNA v kombinaci s elektronovou tomografií umožnilo navrhnout nový model organizace replikované DNA. Replizomy v HeLa buňkách jsou během DNA replikace zjevně organizovány v párech a replizomový pár pravděpodobně vytváří DNA smyčku ve formě čtyř těsně asociovaných 30 nm vláken (Ligasová et al., 2009).

Reorganizace chromatinu v důsledku transkripční a replikační aktivity ribozomálních genů

• S využitím tohoto modelového systému se podařilo ukázat, že replikační a transkripční aktivita ribozomálních genů HeLa buněk je přepínána v rámci celých funkčních jednotek obsahujících více genů (Pliss et al., 2005), a že transkripčně aktivní geny jsou součástí denzních fibrilárních komponent jadérka (Koberna et al., 2002; Malínský et al., 2002).
• Rovněž byla studována transkripční aktivita NORů během buněčného cyklu a asociace NOR-chromozomů s jadérky. Asociace NOR-chromozomů s jadérkem závisela na transkripční aktivitě příslušných NORů (Kalmárová et al., 2007). Zjistilo se, že i když postmitotické dceřiné buňky většinou obsahovaly různé počty jadérek, charakter asociace NOR-chromozomů s jadérkem byl v dceřiných buňkách podobný, na rozdíl od buněk nepříbuzných (Smirnov et al., 2006; Kalmárová et al., 2008a). V buňkách exprimujících UBF-GFP bylo zjištěno, že transkripčně kompetentní NORy jsou během mitózy asymetricky rozděleny mezi dceřiné buňky (Kalmárová et al., 2008b).
• Ve společné práci s laboratoří prof. I. Grummtové (German Cancer Research Centre) z Heidelbergu bylo ukázáno, že remodelační komplex NoRC je určujícím faktorem při časování replikace ribozomálních genů a že epigenetické značky jsou během replikace DNA zachovávány (Li et al., 2005).
• Do jadérka se podařilo lokalizovat multifunkční protein Pontin a prokázat, že Pontin se uplatňuje v regulaci rRNA syntézy zprostředkované c-myc (Cvačková et al., 2008).
• Výsledky spolupráce s laboratoří dr. J. McNallyho (NIH, Bethesda) ukázaly na potencionální úlohu ubikvitinu a proteasomu v biogenezi ribozomů (Stavreva et al., 2006).
• Problematika struktury a funkce jadérka, včetně korelace procesů probíhajících v jadérku s nukleolárními strukturami pozorovanými v mikroskopu, byla shrnuta v několika přehledových článcích (Raška et al., 2006a,b; Cmarko et al., 2008).

Sestřih pre-mRNA

• Výsledky získané v této oblasti umožnily navrhnout dynamický model vzájemného pohybu RNA transkriptů z míst transkripce a sestřihových faktorů do míst transkripce (Melčák et al., 2000; Melčák and Raška, 1996).
• Jaderné skvrny byly identifikovány jako místa, kde probíhá sestavování sestřihového komplexu (Melčák et al., 2001; Kopský et al., 2002).
• Problematika jaderných skvrn byla dále rozpracována v práci Večerová et al., (2004). Bylo ukázáno, že vytváření a dynamika jaderných skvrn nezávisí na přítomnosti laminů A/C.
• Úloze Cajalových tělísek v buněčném jádře byl věnován přehledový článek. Cajalova tělíska, jejichž funkce v buněčném jádře byla dlouho neznámá, hrají klíčovou roli při vytváření funkčních snRNP (Staněk and Neugebauer, 2006).

Struktura nukleozomu a základní nukleozomální částice obsahující variantní histony, remodelace nukleozomu chromatinovýmí remodelačními komplexy

• Ve spolupráci s laboratoří Dr. S. Dimitrova (Ústav Alberta Bonniota, Grenoble, Francie) se podařilo strukturálně a biochemicky charakterizovat nukleozom obsahující variantu Bbd histonu H2A. Výsledky AFM a kryo-elektronové mikroskopie ukázaly, že histonový oktamer obsahující H2A.Bbd organizuje pouze přibližně 130 párů bazí DNA (oproti 145 u konvenčního oktameru) a naznačily, že 10 párů bazí na obou koncích nukleozomální DNA jsou z oktameru disociovány, což má pravděpodobně za následek nižší stabilitu částice (Doyen et al., 2006). Podobné vlastnosti byly detekovány u nukleozomu obsahující histon H2A.L2, variantní formu histonu H2A specifickou pro tkáň myších varlat (Syed et al., 2009) .
• Kryo-elektronová mikroskopie umožnila získat zásadní výsledky o strukturních vlastnostech nukleozomu. Ukázalo se, že protein NAP-1 velmi efektivně asociuje spojovací histon do struktury nukleozomu a že NAP-1 je schopen asociovat také izolovanou globulární doménu histonu H1, jakož i jeho mutanty.
• Experimenty studující průběh remodelace nukleozomu působením remodelačního komplexu RSC odhalily vznik metastabilního (řádově několik desítek minut až několik hodin) reakčního meziproduktu - nukleozomu s modifikovanou strukturou. Prokázalo se, že tato forma nukleozomu asociuje s dalšími 20 až 40 páry bazí, což vede k disociaci DNA od histonového oktameru uvnitř nukleozomu a následně k deformaci jeho jinak cirkulární formy. To vede k výraznému zvýšení přístupnosti k nukleozomální DNA v porovnání s intaktní částici .

Nové technologie a nanotechnologie

Vývoj a konstrukce programovatelného maticového mikroskopu (PAM)

Zcela speciální místo zaujímá projekt zabývající se vývojem, konstrukcí a využitím nového typu světelného mikroskopu, tzv. programovatelného maticového mikroskopu (PAM, Programmable Array Microscope), jehož parametry převyšují parametry komerčně dostupných konfokálních mikroskopů. Vzorky budou v PAM osvětlovány různými osvětlovacími obrazci vytvářenými světelnými modulátory s tekutými krystaly, které jsou podstatně rychlejší a ovladatelnější než běžně používané piezoelektricky ovládané difrakční mřížky.

Výhody PAM lze v zásadě využít dvojím způsobem:

1. Pro 4D zobrazování dynamických buněčných jevů, při nichž použijeme cíleně transfekované buňky syntetizující rekombinantní proteiny s fotoaktivovatelným nebo fotokonvertibilním fluoreskujícím proteinem (např. Cvačková a spol., 2009). Odhadujeme, že PAM bude asi 10x citlivější než stávající bodově rastrující konfokální mikroskopy, což umožní výrazně snížit dávku světla nutnou k zobrazování (Hagen a spol., 2007). Tím se též výrazně zredukují další negativní vlivy - fototoxicita a fotovybělování – což umožní snímat sledované procesy v živých buňkách častěji a po delší dobu.
2. Pro vysokorezoluční zobrazování. Zavedením strukturovaného osvětlení (SIM mikroskopií) umožní PAM jednak zisk optických řezů, ovšem jeho hlavní přínos je v dosažení dvojnásobného rozlišení mikroskopických obrazů, tj. překročení Abbeho difrakčního limitu. SIM mikroskopie je souhrnným označením souboru mikroskopických a výpočetních metod, které využívají vlastností sinusově modulovaného osvětlení fluoreskujícího vzorku.

Se stávajícím prototypem PAM byla měřena boční difuse erbB3-mCitrinových molekul. Měření proběhlo jednak v buňkách kontrolních a jednak v buňkách exogenně ovlivněních látkami, které narušují cytoskelet, plazmatickou membránu anebo aktivují koexprimovaný erbB1 (Hagen a spol., 2009). Významný přínos PAM očekáváme vzhledem k vyššímu rozlišení, citlivosti a univerzálnosti zejména při výzkumu buněčného jádra.

Úspěšná finální konstrukce PAM bude pro pracoviště znamenat získání vysoce citlivého mikroskopu umožňujícího zobrazování živých buněk v reálném čase s vysokým rozlišením.

Jednomolekulová lokalizační mikroskopie (SMLM)

Jednomolekulová (single-molecule) lokalizační mikroskopie je nová a velmi efektivní světelně mikroskopická metoda umožňující dosažení rozlišení daleko za hranicí stanovenou Abbeho difrakční mezí. Princip metody spočívá v lokalizaci individuálních molekul, které lze dopadajícím světelným tokem „rozblikat“, tj. rychle přecházet mezi emisí fotonů a neemisním stavem. Původně byl pro tuto metodu, nazývanou PALM (Fotoaktivační lokalizační mikroskopie) vhodný pouze fluorescenční protein Dronpa, později však bylo ukázáno, že pro tuto metodu jsou vhodné i jiné fotokonvertibilní a fotoaktivovatelné proteiny jako jsou GFP, Dendra a EOS. Tato modifikace v jednomolekulové lokalizační mikroskopie vyžaduje pouze vysoce intenzivní osvětlení vzorku.

Na ÚBBP již byla sledována exprese erbB3-mCitrinu v buňkách A431. Tento gen je exprimován nebo alespoň přítomen v mutantních formách několika typů maligních tumorů zejména prsu a mozku, a proto je velmi důležitý pro cílenou léčbu nádorů. Docílené superrozlišení činilo 20 nm, tedy desetinásobné zlepšení rozlišení ve srovnání se standardním zobrazením.

Nanotechnologie

• Kryo-elektronovou mikroskopií, jako jedinou možnou metodou pro nativní sledování nanočástic, byla ve spolupráci s Univerzitou v Krakově uskutečněna morfologická analýza silika-silikonových nanokapslí připravených metodou templátové polymerace (Kepczynski et al., 2009, 2010).
• Ve spolupráci s Přírodovědeckou fakultou Univerzity J.E. Purkyně v Ústí nad Labem byly studovány strukturní, optické a elektrochemické vlastnosti nanokompozitních plazmových polymerů typu Cín/Plazma. Tyto materiály se připravují magnetronovým naprašováním atomů cínu ve smíšené atmosféře Ar a n-hexanu, čímž vzniká tenká vrstva typu kov/dielektrikum, v níž jsou částice kovu začleněny do polymerové matrice. Elektronovou tomografií bylo zjištěno kovové částice ve vrstvách typu cín/plazma nemají pravidelný tvar a jsou nepravidelně rozmístěny v matrici kompozitu (Matoušek a spol., 2009). Dále bylo zjištěno, že základní fyzikální vlastnosti těchto materiálů zásadně závisí na způsobu jejich přípravy.
• Ve spolupráci s PřF UJEP v Ústí nad Labem dále provádíme transmisní elektronovou mikroskopií morfologickou analýzu nově syntetizovaných nanočásticových markerů se selektivními biorozpoznávacími vlastnostmi založených na bázi tzv. PAMAM dendrimerů. V nově syntetizovaných biotinylovaných nanokompozitních markerech typu stříbro-dendrimerový polymer (bio-AgDNC a bio-PEG-AgDNC) se formují nanočástice stříbra - u bio-AgDNC vytvářejí atomy stříbra shluky o průměrné velikosti 4,6 nm, což odpovídá jejich lokalizaci ve volném prostoru uvnitř dendrimerového řetězce, kdežto u bio-PEG-AgDNC se naproti tomu vytvářejí shluky o dvou typických průměrech: 2,5 nm pro částice internalizované v řetězci dendrimerového polymeru, a 14,8 nm pro částice stabilizované vnějším povrchem bio-PEG-dendrimerového polymeru. Anti-biotin-imunoznačením bylo prokázáno zachování funkce biotinu (Malý a spol., 2009).